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微生物学实验课程内容

微生物学实验课程

实验一  细菌的革兰氏染色

一、内容:1、学习普通光学显微镜的基本使用  

二、菌种:

      1、大肠杆菌     (Escherichia coli    简称  E. coli)

      2、金黄色葡萄球菌  (Staphylococcus aureus    简称   S.a.)

三、操作

1、涂片:分别取 S. a 和 E. coli 在同一玻片做三个涂片区

2、干燥:自然干燥

3、固定 :干燥后火焰固定

4、初染:滴结晶紫染 1分钟,水洗

5、媒染:滴碘液染 1分钟,水洗

6、脱色:连续用95%乙醇脱色,20秒以内,

                 立即水洗

7、复染:番红染色3-5分钟,水洗,

                 吸水纸吸去多余水分

8、镜检:按10x ,40x ,100x顺序镜检,

              观察两种菌的菌体形态、颜色变化

实验二  细菌的芽胞和荚膜观察,放线菌观察

一、菌种:

    1、芽胞观察:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis      B. t)

    2、荚膜观察:胶质芽胞杆菌(Bacillus  mucilaginosus      B.m)

    3 、放 线 菌:天蓝色链霉菌(Streptomyces)

二、操作:

(一)芽胞观察

      1、制片:取 B. t  涂片(操作方法同 简单染色)→ 干燥 → 固定

      2、染色:滴结晶紫染色 1~ 2 分钟,水洗,

      3、镜检:按10x ,40x ,100x 顺序镜检,观察B. t 的芽胞

(二)印片染色法观察放线菌

     1、制片:用小刀划取长有放线菌的琼脂培养基一块,有菌面向上放在载玻片上,用另一块干净载玻片对准菌块,在不同位置轻按 3 次,使菌块上的气生菌丝印在载玻片上(注意不要使载玻片在培养体上滑动,以免打乱孢子丝的形态)。

 

  2、固定:将印有放线菌的涂面向上,

            通过酒精灯火焰3-4次

  3、染色:复红染色1-2分钟

 4、水洗、晾干(不能用吸水纸吸干)

 5、镜检:10x ,40x ,100x 物镜观察

            气生菌丝、孢子丝的形态。

实验三   细菌的鞭毛染色、运动性观察和蓝细菌的形态观察

一、实验内容与菌种

       1、细菌的鞭毛染色:枯草芽胞杆菌 (Bacillus subtilis)

        2、细菌的运动性观察:枯草芽胞杆菌 (Bacillus subtilis )

        3、蓝细菌形态观察: 满江红鱼腥蓝细菌(Anabaena azollae)

二、实验原理

三、实验步骤 :

  (一)细菌的鞭毛染色 (枯草芽胞杆菌 )

1、于一洁净载玻片上等分三个区域(用专用载玻片)。

2、在载玻片一端滴1滴菌悬液,倾斜载玻片,使菌悬液缓慢从一端流至另一端。

3、空气中自然干燥。

4、加染色液于第一区,3分钟后再加染色液于第二区,依次类推。

5、载玻片平置,加蒸馏水充盈,然后用洗瓶小心洗去染料,自然干燥。

镜检(100X)

  (二)细菌的运动性观察 (枯草芽胞杆菌 )

       直接制备枯草芽胞杆菌水浸片加盖玻片观察, 10X,40X(注意镜检时适当缩小光圈或降低聚光器)    

  (三)蓝细菌形态观察

       制备水浸片:于一洁净载玻片上滴加蒸馏水1滴,取红萍少许,加盖玻片压

       片。镜检10X,40X(光线适当减弱,注意异形胞的形态)。

  • 作业 :  1、绘制鞭毛形态图 (100X);      2、绘制蓝细菌( 40x)形态图

实验    微生物的细胞大小测定及数量测定

一、实验目的:

      掌握细胞大小的测定方法和计数板测定细胞数量的方法

二、实验材料:

    1、菌种:酿酒酵母

    2、器材:显微镜、血球计数板、镜台测微尺、目镜测微尺

三、实验内容:

    1、测定微生物细胞的大小

    2、微生物细胞的显微直接计数法

四、实验步骤:

  (一)微生物细胞大小测定

     1、目镜测微尺的校正

       镜台测微尺有刻度的一面朝上,置显微镜载物台上(目镜测微尺已在显微镜筒

       中),先10x,后40x,计算40x下目镜测微尺的校正值。镜台测微尺放入盒中。

     2、细胞大小的测量

      于载玻片滴加酵母菌悬液1滴,加盖玻片,用目镜测微尺测量细胞大小(宽和长)

  (二)细胞数量测定

        先将大盖玻片盖在血球计数板上,再从盖玻片边缘将酵母菌悬液滴入计数室(或者, 在计数区滴加菌悬液后再盖上盖玻片)。于10X找到计数区,再调至40X,适当减弱光强,计数(统计5个大格中的酵母菌数量)。

 

实验六、真菌形态观察

一、菌种:(1)假丝酵母 (Candida  sp.):观察假菌丝、芽孢子

  (2)葡枝根霉 (Rhizopus stolonifer):观察孢囊孢子,假根

 (3)黑曲霉 (Aspergillus niger): 观察分生孢子,顶囊,足细胞

 (4)青霉 (Penicillum  sp.):  观察帚状分生孢子梗

 二、实验步骤

(一)水浸片法观察黑曲霉:

     用解剖针(每人发2支)挑少量曲霉菌块(适当带一点培养基)放在载玻片的一侧,滴加50%乙醇一滴,玻片另一侧加一滴蒸馏水。将菌块在乙醇中轻轻拨动几下,洗去大部分孢子,再将菌块移到蒸馏水中,用解剖针将菌丝尽量分散,盖上盖玻片,用橡皮或塑料轻轻敲击,压散菌丝。用10x,40x 物镜观察菌丝、足细胞、分生孢子梗、顶囊。

 从土壤中稀释分离微生物及生理生化鉴定

实验目的:

  1. 熟练掌握微生物基础操作技术
  2. 了解并掌握培养基配置方法及注意事项,土壤微生物稀释分离及生理生化鉴定实验过程。
  3. 强化学生对微生物操作中严谨的实验态度及实验过程。

实验内容:

第一次内容:配制培养基、准备实验材料

全班分为8个组,每组4人,准备如下物品:

1、培养基配置:

第1、2组:牛肉膏蛋白胨培养基斜面,每组500mL (固体,p155-1),

                    分装50支试管

第3、4组: 牛肉膏蛋白胨培养基(固体,p155-1),每组2000mL,分装10瓶。

第5、6 、7、8组:马丁孟加拉红培养基 (固体 p155-6),每组1000mL,分装5瓶。

配制方法:取适量蒸馏水于容器中→按培养基配方顺序依次称量药品,溶解于水

                  中(可适当加热帮助药品溶解)→ 定容 →调pH →分装入500 mL

                  三角瓶,每瓶200 mL,并加入琼脂3克→加瓶塞,包扎。

2、其它器材,每组准备:

1)无菌水:1瓶蒸馏水,90mL / 瓶,加玻璃珠8-10粒(大蓝盖瓶) 。  1瓶蒸馏水,50mL / 瓶(小蓝盖瓶)。

  1. 装 1.5mL塑料离心管 20只/包,共2包。
  2. 装 1mL 塑料吸头2盒。
  3. 培养皿:  每人用报纸包 1筒培养皿,11 皿 / 筒。 注意:培养基请标上专业和班级,写在纸上。
  1. 灭菌:物品放入大铁丝筐 → 送灭菌室灭菌备用。

第二次实验:从土壤中稀释分离微生物

一、熔化固体培养基,倒平板:

            2个同学1组,取牛肉膏1瓶,马丁孟加拉红1瓶,微波炉内熔化。待培养基冷却至55℃,将培养基倒入培养皿,每瓶培养基分装11皿。其中马丁孟加拉红培养基在倒培养皿前,每瓶加入链霉素2 mL。

二、土壤悬液制备

            每大组(4人)准备1瓶土壤悬液:称10克土壤放入带玻璃珠的90mL 瓶装无菌水中,振荡15min,使土样分散。

三、悬液稀释:每2个同学做一套土样的系列稀释液,方法见图。

四、悬液涂布

            每个同学按图示取0.1mL菌悬液于相应培养皿内,每稀释度3皿,3个稀释度,共9皿。另以无菌水做一皿空白对照。

            一皿做划线分离。

五、培养:

            每个同学将培养皿用报纸包好(培养皿方向一致),写上班级和姓名,皿底朝上,放入铁丝筐, 28℃培养,下周看结果。每2个同学共用1组数据。

 

 

 

 

土壤悬液稀释示意图

第三次实验:土壤微生物的稀释分离与计数(3)细菌的生理生化鉴定-(Ⅰ)配制生理鉴定培养基

一、实验内容:

(一)土壤微生物的稀释分离与计数

1、挑2个细菌单菌落转斜面

2、统计稀释测数结果

(1)细菌:选择每皿菌落数30-300的稀释度进行计数

(2)真菌:选择每皿菌落数10-100的稀释度进行计数

(3)结果计算(请写出原始数据和计算过程)

(4)完成“土壤微生物的稀释分离与计数”的实验报告

3、清洗培养皿。

(二)分组配制生理鉴定培养基并准备相关试验用器材(见下页)。

二、实验目的:学习几种主要微生物的生理代谢试验及检验方法

三、实验分工:                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                              

(一)、每8人一组准备如下器材:

 1、每组包4筒培养皿(10套/筒);每组做9ml无菌水10支。

 2、每组打滤纸片100个,单层装入培养皿中灭菌备用。

(二)全班分4个小组(8人/组),每组配一种生理鉴定培养基(培养基配方见课本;试剂不用配)。

第1组(1)配2000ml碳源试验基础培养基(固体培养基):分装20个三角瓶,每瓶100ml,并加琼脂粉1.5克,灭菌备用。(2)配0.1%的醋酸钠溶液100ml;(3)配1%的葡萄糖100ml;(4)配0.5%的牛肉膏溶液100ml, (2)-(4)各装于1个大蓝盖瓶中,贴好标签。

   第2组(1)配2000ml氮源试验基础培养基(固体培养基):分装20个三角瓶,每瓶100ml, ,并加琼脂粉1.5克,灭菌备用。(2)配0.1%的硫酸铵100ml;(3)配0.1%硝酸钾100ml, (4)配1%蛋白胨100ml, (2)-(4)各装于1个大蓝盖瓶中,灭菌备用。

   第3-8组各配1000ml液体培养基,装100支试管,每个贴好标签。

第四次实验:细菌生理鉴定-Ⅱ 生理鉴定接种

一、实验目的:

   学习生理试验的接种方法;进一步熟悉无菌操作。

二、实验内容:每4人一组

(1)每人选择自己所接细菌斜面一支,加入9ml无菌水用接种环轻轻刮取制成菌悬液,再倒回装无菌水的空试管内。

(2)用移液器取0.1ml分别接入生理鉴定液体培养基3-8(糖发酵、MR、VP、产氨、硝酸还原、吲哚)中。

    同上,每4人一组接种一套大肠杆菌作对照。

(3)C源试验,N源试验:每4人取C、N培养基各一瓶,熔化后各倒5个平板,每人各分1个(C源、N源各1个;4人剩余各1个做对照)。取菌悬液0.1ml到平板中,涂布均匀。静置5分钟以上,再加浸有不同C源、N源的滤纸片(注意在皿底做C源、N源滤纸片标记)。以上操作在超净台进行。

    同上,每4人一组,取C源、N源平板以大肠杆菌做对照。

  1. 接种后,28℃培养。

第五次实验:细菌生理鉴定-Ⅲ 结果检验

一、实验目的:通过实验,了解不同微生物对不同碳源、氮源的利用情况及其代谢产物。从而认识微生物代谢类型的多样性。

二、实验内容:

1、由实验人员准备以下检测试剂,每8个同学一套。

   ① M.R.试验:甲基红试剂   3-4滴

   ② V.P.反应:40%NaOH(10-20滴),5%α萘酚(10-20滴)、

              肌酸(少量),酒精灯加热。

   ③硝酸盐还原反应:分两份,

           一份加格利斯试剂Ⅰ、Ⅱ(各一滴)。

     另一份加锌粉(少量)后加热,再加加格利斯试剂Ⅰ、Ⅱ(各一滴)。

   ④产NH3 试验:加纳氏试剂(3-5滴)。

   ⑤吲哚试验:加1ml乙醚,震荡后静止,再加吲哚试剂10滴,不要摇动。

2、学生按实验书所介绍的操作方法进行生化反应试验,将实验结

      果填入下表中(四人一组结果共享)

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