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微生物学基础实验课程教学内容

微生物学基础实验课程内容

实验一  细菌的革兰氏染色

一、内容:1、学习普通光学显微镜的基本使用  

二、菌种:

      1、大肠杆菌     (Escherichia coli    简称  E. coli)

      2、金黄色葡萄球菌  (Staphylococcus aureus    简称   S.a.)

三、操作

1、涂片:分别取 S. a 和 E. coli 在同一玻片做三个涂片区

2、干燥:自然干燥

3、固定 :干燥后火焰固定

4、初染:滴结晶紫染 1分钟,水洗

5、媒染:滴碘液染 1分钟,水洗

6、脱色:连续用95%乙醇脱色,20秒以内,

                 立即水洗

7、复染:番红染色3-5分钟,水洗,

                 吸水纸吸去多余水分

8、镜检:按10x ,40x ,100x顺序镜检,

              观察两种菌的菌体形态、颜色变化

实验二  细菌的芽胞和荚膜观察,放线菌观察

一、菌种:

    1、芽胞观察:苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis      B. t)

    2、荚膜观察:胶质芽胞杆菌(Bacillus  mucilaginosus      B.m)

    3 、放 线 菌:天蓝色链霉菌(Streptomyces)

二、操作:

(一)芽胞观察

      1、制片:取 B. t  涂片(操作方法同 简单染色)→ 干燥 → 固定

      2、染色:滴结晶紫染色 1~ 2 分钟,水洗,

      3、镜检:按10x ,40x ,100x 顺序镜检,观察B. t 的芽胞

(二)印片染色法观察放线菌

     1、制片:用小刀划取长有放线菌的琼脂培养基一块,有菌面向上放在载玻片上,用另一块干净载玻片对准菌块,在不同位置轻按 3 次,使菌块上的气生菌丝印在载玻片上(注意不要使载玻片在培养体上滑动,以免打乱孢子丝的形态)。

 

  2、固定:将印有放线菌的涂面向上,

            通过酒精灯火焰3-4次

  3、染色:复红染色1-2分钟

 4、水洗、晾干(不能用吸水纸吸干)

 5、镜检:10x ,40x ,100x 物镜观察

            气生菌丝、孢子丝的形态。

实验三、真菌形态观察

一、菌种:(1)假丝酵母 (Candida  sp.):观察假菌丝、芽孢子

  (2)葡枝根霉 (Rhizopus stolonifer):观察孢囊孢子,假根

 (3)黑曲霉 (Aspergillus niger): 观察分生孢子,顶囊,足细胞

 (4)青霉 (Penicillum  sp.):  观察帚状分生孢子梗

 二、实验步骤

(一)水浸片法观察黑曲霉:

     用解剖针(每人发2支)挑少量曲霉菌块(适当带一点培养基)放在载玻片的一侧,滴加50%乙醇一滴,玻片另一侧加一滴蒸馏水。将菌块在乙醇中轻轻拨动几下,洗去大部分孢子,再将菌块移到蒸馏水中,用解剖针将菌丝尽量分散,盖上盖玻片,用橡皮或塑料轻轻敲击,压散菌丝。用10x,40x 物镜观察菌丝、足细胞、分生孢子梗、顶囊。

实验四     酵母细胞的大小及数量测定

一、实验内容:测定酵母细胞的大小,单位体积内的细胞数量

二、实验材料:1、菌种:酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae )

          2、器材:显微镜、血球计数板、镜台测微尺、目镜测微尺

三、实验步骤:

  (一)细胞大小测定

 1、对目镜测微尺的校正:镜台测微尺有刻度的一面朝上,置显微镜载物台上(目镜测微尺已在镜筒中),先用10x找到镜台尺刻度,然后在40x进行目镜测微尺校正。(尽量取重叠格数多的数据进行计算)

 2、细胞大小的测量

         酵母菌悬液滴在载玻片上,盖上盖玻片(用培养皿中装的小盖玻片),显微镜光圈调暗, 用目镜测微尺测量细胞宽和长,注意将盖玻片上的杂质与酵母细胞区分开。

  (二)细胞数量测定

       在血球计数板计数区滴加菌悬液后再盖上盖玻片(用长方形大盖玻片)。显微镜光圈调暗,先于10 X 找到计数区,再在10 X 或 40 X 下计数。(数3个大格,注意将盖玻片上的杂质与酵母细胞区分开)。

实验(五) :配培养基、准备实验材料  

    每4 个同学组成1个大组,每大组准备如下物品:

1、配培养基: 1000mL / 大组,配方见实验书  P155

         A1-4、A5-8、B1-4、B5-8 组:牛肉膏蛋白胨培养基              ,

         C1-4、C5-8、D1-4、D5-8 组:马丁(Martin)-孟加拉红培养基

配制方法:(1)称药品 (先称无机盐,后称有机物)于瓷量杯中,加自来水1000mL,

     搅拌溶解(可稍微加热)后,牛肉膏培养基 调pH至 7.0-7.2,马丁培养基每杯加孟加拉红 10 mL(此次不加链霉素)。

       (2)琼脂粉先称至各个三角瓶中, 3克 / 瓶(1.5%)。用量筒取液体培养基灌入三角瓶,200mL / 瓶,  5瓶 / 组。塞瓶塞,用废书页包瓶口。

2、灭菌水:

         向250mL大蓝盖瓶加自来水90mL,并加玻璃珠8-10粒,1瓶 / 组。

         向80 mL小瓶加水 50mL,不加玻璃珠, 1 瓶 / 组。

                             (瓶盖都不要旋得太紧)

3、塑料耗材:每组用朔料袋装 1.5mL塑料离心管12-14只,封口机封口。

   每组用塑料盒装 1mL 塑料吸头 (1mL tip) 1盒, 橡皮筋捆扎。

4、培养皿:  每人用报纸包 1筒培养皿,11皿 / 筒。

以上物品放入大铁丝筐,送至 1楼东侧A120灭菌室。

 实验(六) 从土壤中稀释分离微生物

一、土壤悬液制备:每 4 个同学准备1瓶土壤悬液:称10克土壤放入

                 带玻璃珠的90ml瓶装无菌水中,手摇振荡,使土样分散。

二、悬液稀释:每2个同学做一套土样悬液的系列稀释,方法见下图:

三、制备固体琼脂培养基平板:

        做同一套悬液操作的2个同学,其中1人制备牛肉膏平板,另1人制备马丁孟加拉红平板。培养基熔化方法见微波炉上的说明。马丁氏培养基融化后每瓶( 200ml )加 0.3% 的链霉素 2mL,摇匀。每瓶培养基倒10~11皿。

四、悬液涂布:

       做同一套悬液操作的2个同学,其中1人涂牛肉膏平板,另1人涂马丁平板,涂布前,先在皿底标记稀释度。每种平板涂3个稀释梯度,每梯度3个重复,另用1块涂无菌水做空白对照。每个人用 3 x 3 + 1 = 10块平板。

五、培养:每人涂的10块板用报纸包好(盖、底方向一致), 写上班级和姓名。皿底朝上,盖朝下放铁丝筐,28OC培养( 东侧A122室 ), 下周看结果。

 

实验(七)看结果   

1,我所涂平板种类:         (牛肉膏或马丁氏)

2,计数:牛肉膏平板取单菌落数目在30~300个左右的稀释度来计数,马丁氏平板取单菌落数目在10~100个左右的稀释度来计数:

我所计数的平板稀释度是:          ,单菌落数目:      、     、      。

3,计算:活菌数目/每克土=          (计算过程)=       个/每克土

 

 

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