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细胞工程实验课程内容

拟球状念珠藻的人工培养综合实验

 

专业  生物工程                     

学时 10

 

实验原理

拟球状念珠藻(Nostoc sphaeroides)又称葛仙米,是一种淡水微藻,属蓝藻纲,念珠藻科,念珠藻属,具异形胞,可固氮。其是一种很好的生物氮肥来源,在维持所在生态系统的平衡和稳定中占有重要地位。其胶群体成球形,直径可达几厘米,生长于山区稻田、浅水池沼和湖、溪的砂石间,是地球上最早出现的原核光合生物之一。藻殖段或厚壁孢子是其繁殖的主要形式,因其早期发育阶段不为人们肉眼所见,为其附上了神秘色彩,当地人又将其称为天仙米和天仙菜。

    “葛仙米”名称源于东晋道学家、炼丹家葛洪(人称“葛仙公”)有关。传说葛洪隐居“南土”时,曾采此藻为食,发现其味道鲜美,营养丰富,有药用价值。现代研究证明葛仙米富含具有生物学活性的蓝藻多糖、蛋白质、维生素和多种微量元素等,有很高的食用和药用价值,是汇集众多优点于一身的药食同源绿色保健品和“固氮工厂”。

      葛仙米是湖北著名土特产,恩施州鹤峰县是葛仙米的重要原产地。其出口历史悠久,主要销往日本和东南亚,每斤干品价格在1千元左右。葛仙米产品目前主要来源于野生资源。每年深秋至次年早春的灌水稻田是葛仙米生长的主要场所,采集出售葛仙米是当地农民重要的经济来源之一。但近年来由于农药和化肥的大量使用和过度采摘,当地野生葛仙米的资源日渐枯竭,限制产业发展。

      葛仙米细胞中含有叶绿素、藻胆蛋白和类胡萝卜素等集光色素,能高效吸收和利用太阳光源,进行光合作用,其含有的固氮酶可将空气中的N2转化为NH4+,因此在其养殖时仅需提供合适光源、碳源和少量无机元素即可实现快速增值。

      本学期生物工程专业学生的细胞工程实验为综合性实验,实验主要内容为探讨不同营养、光照、酸碱度等对葛仙米细胞生长的影响。

 

实验目的

1了解藻类规模化培养的基本流程;

2了解并掌握营养、光照、酸碱度等环境因子对植物细胞生长的影响;

3  掌握藻类细胞培养的基本技术。

4 通过虚拟实验练习,掌握综合实验的基本实验步骤和方法。

 

实验用品

    1.器具:2L量杯、天平、 20L培养瓶、10 ml移液管、洗耳球、带塞试管、量筒、大试管架(放大培养管用)、通气管、通气泵、CO2、溶氧仪、pH计、照度计、光化学效率分析仪。

    2.材料:拟球状念珠藻藻

    3.试剂

BG110 培养基

储备液1:

Mg Na2 EDTA   1g L-1

柠檬酸铁铵     6g L-1

柠檬酸         6g L-1

CaCl2·2H2O     36g L-1  

储备液2:

MgSO4·7H2O    75g L-1

储备液3:

K2HPO4·3H2O   40g L-1

储备液4:

NaCO3         20 g L-1

储备液5: (微量元素)  

H3BO3         2.86g L-1

MnCl2·4H2O    1.81g L-1

ZnSO4·7H2O    0.222g L-1

CuSO4·5H2O    0.079g L-1

COCl2·6H2O    0.050g L-1

NaMoO4·2H2O  0.391g L-1

使用时依次取10ml储备液1、2、3、4、5加入到20 L水中,加入一种摇匀后再加入另一种。配制固体培养基时,在配好的培养基中按1.5%的比例加入琼脂,加热溶解后,灭菌备用。

 

内容与方法

1 藻类细胞的培养

      藻种活化

      将保存在固体培养基上的藻种用接种针或接种产刮下少许,放到盛有灭菌后BG11(加1.5 g/ L NaNO3)培养基的50mL三角瓶中,在2000Lux 光强和25℃下培养,间歇振荡,当细胞生长到密度较大时,转入到通气管中进行通气培养,逐步进行梯级扩大培养。为了使藻类生长地更快,可通入1%CO2并增加光强。

接种及培养:

称取500-1000g藻,接种到20L培养瓶中进行通气培养;光照条件设置三种:高光(培养基最上层)、低光(培养架最下层)和稳定光低光(培养架中层,用黑色塑料袋遮住外源太阳光),三种条件下均有人工光源提供。培养基中设置四种营养条件,即对照(每瓶加四种母液各10mL)、高钙(每瓶加四种母液10mL,再额外加100mL钙)、高磷(每瓶加四种母液10mL,再额外加100mL磷)和高氮(每瓶加四种母液10mL,再额外加5mL氮)四种,培养过程中,定期测定细胞活性和材料重量。

2  生长曲线的测定

 鲜重法:每7天取一定体积的藻样,过滤后沥干藻体表面水分后称重,每实验处理样品计数3次,取平均值。

直径测量法: 取50粒葛仙米排成一行,量取长度,计算平均直径。

生长速率按如下公式计算:

                 μ=(LnNt-LnN0)/(T-T0)

其中,μ为相对生长速率,Nt是时间T时的重量,N0是初始时的重量。

   

3 溶氧和pH测定

 取样杯取30mL样,将溶氧仪或pH及探头插入水中,不停摇动,待读数稳定后记录数据。

4  光强测定

   取出照度计,打开开关,移除光探头盖子,适当调整角度将光探头对准测定光源,选择适当量程,进行测定,待读数稳定后记录数据。

 

实验结果

各组同学根据实验设计及测得的实验数据,分析实验结果,撰写实验报告。每小组递交一份实验报告。

主要分析内容如下

(1) 分析不同光照条件下葛仙米生长差异的原因。

(2) 各种营养对葛仙米的生长有何不同?为什么?

(3 )光照强度、气温、水温、酸碱度和光合系统光化学效率在一天中如何变化?各因子间如何相互影响?它们和葛仙米生长间有何关系?如何采取适当人工干扰来提高葛仙米产量?

虚拟实验网址:swx.hazu.edu.cn

    学生们进入以上网址,用自己的学号登陆平台,认真完成虚拟藻类规模化培养的实验内容,实验过程中有任何问题,及时与老师沟通。

实验考核(100)

实验考核由三部分构成:

自评分数(40%):各小组根据每个成员在实验过程中的贡献度,自评每位成员的分数。

教师评分(40%):教师根据每小组的实验报告的完整性、实验数据的真实性以及实验数据的偏差度,根据每位学生实验过程的表现等,给予评分。

虚拟实验(20%):根据学生在虚拟实验平台操作的时间和次数以及对虚拟实验内容 的提问考核,评定该部分成绩。

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